Analiza miejsc powstawania dwuniciowych pęknięć DNA w kontekście zmienności osobniczej oraz organizacji przestrzennej chromatyny w genomie ludzkim

Dwuniciowe pęknięcia DNA (ang. double strand breaks, DSBs) powstają w wyniku przerwania wiązań fosfodiestrowych jednocześnie w obu niciach podwójnej helisy DNA. Takie uszkodzenia powodowane są przez szereg czynników, zarówno egzogennych (np. promieniowanie jonizacyjne, promieniowanie UV, jony metali ciężkich czy szereg związków chemicznych), jak i endogennych (np. reaktywne formy tlenu, bariery dla widełek replikacyjnych czy konflikty między replikacją i transkrypcją). Choć DBSs są konieczne dla przeprowadzenia niektórych naturalnych procesów komórkowych, takich jak mejoza czy rearanżacja genów VDJ, z reguły stanowią one poważne niebezpieczeństwo dla prawidłowego funkcjonowania komórki. Potencjalnie nawet jedno DSB wystarczy, by spowodować śmierć komórki, prowadząc do utraty fragmentów chromosomów lub ich rearanżacji. Z tego względu DSBs uważa się za jedną z głównych przyczyn niestabilności genetycznej, cechy charakterystycznej większości nowotworów i schorzeń neurodegeneracyjnych. Poznanie mechanizmów odpowiedzialnych za powstawanie DSBs jest więc szczególnie istotne dla badań nad przyczynami rozwoju i sposobami leczenia ludzkich chorób cywilizacyjnych.

Jak dotąd regiony wrażliwe na powstawanie DSBs, czyli regiony łamliwe (ang. common fragile sites, CFSs), w genomie ludzkim wyznaczone zostały jedynie przy pomocy metod o niskiej rozdzielczości lub specyficzności. Dodatkowo, charakterystyka tych regionów pod kątem możliwych przyczyn ich podatności na pękanie przeprowadzona została tylko w kontekście liniowej struktury genomu, np. w odniesieniu do ich odległości od miejsc startu replikacji czy innych funkcjonalnych elementów genomu. Tymczasem intensywne badania ostatnich lat na polu genomiki trójwymiarowej pokazały, że sposób upakowania DNA w jądrze komórkowym na różnych poziomami organizacji chromatyny takich jak: kompartmenty, domeny topologiczne czy pętle chromatynowe, jest ściśle powiązany z procesami zachodzącymi w komórce tj. replikacja, transkrypcja oraz naprawa DNA. Niewiele wiadomo jest jednak na temat związku pomiędzy przestrzenną strukturą genomu a jego łamliwością, choć istnieją przesłanki sugerujące ich wzajemną zależność. Przykładowo, miejsca stanowiące “kotwice” pętli chromatynowych (ang. loop anchor points) zostały zidentyfikowane jako potencjalne CFSs. W celu dokładniejszego zbadania tego związku niezbędne są jednak dalsze badania, obejmujące między innymi precyzyjne wyznaczenie lokalizacji DSBs w genomie. Detekcja DSBs z rozdzielczością jednego nukleotydu możliwa jest dopiero od kilku lat, dzięki opracowaniu metod opartych na oznakowaniu miejsc pęknięć przez ich ligację in situ ze specjalnie zaprojektowanym, biotynylowanym adapterem. Wyznakowane fragmenty izolowane są z użyciem streptawidyny, amplifikowane, a następnie sekwencjonowane przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji. Jedną z takich metod jest opracowana przeze mnie technika i-BLESS, w której komórki immobilizowane są w kulkach agarozowych, co chroni DNA przed uszkodzeniami mechanicznymi i zapewnia niezwykle wysoką specyficzność i czułość metody.

Głównym celem projektu jest zbadanie zmienności miejsc występowania spontanicznych DSBs w komórkach limfoidalnych oraz określenie związku pomiędzy strukturą przestrzenną genomu a jego łamliwością. Planowane badania będą składały się z następujących etapów:

(1) hodowla komórkowa

(2) znakowanie DSBs w badanych komórkach metodą i-BLESS;

(3) przygotowanie bibliotek genomowych dla wyznakowanych fragmentów;

(4) wysokoprzepustowe sekwencjonowanie DNA i

(5) analiza danych.

Jako model biologiczny zastosowane będą limfoidalne linie komórkowe z rodziny Yoruba (matka-GM19238, ojciec-GM19239 oraz córka-GM19240) z projektu 1000 genomów. Eksperymenty dla każdej z badanych linii wykonane zostaną w dwóch powtórzeniach biologicznych. Przeprowadzenie analizy dla komórek tego samego typu, lecz pochodzących od blisko spokrewnionych osobników, pozwoli na określenie wpływu zmienności osobniczej na powstawanie DSBs oraz przybliżenie mechanizmów dziedziczenia regionów łamliwych. W szczególności, łamliwość poszczególnych obszarów genomu zostanie zbadana w kontekście nowych wariantów strukturalnych obserwowanych w genomie córki, a nie występujących w DNA rodziców. Uzyskane wyniki będą również mogły być skonfrontowane z danymi dotyczącymi lokalizacji ludzkich regionów łamliwych, które zostały już wyznaczone dla komórek limfoidalnych, choć z bardzo niską rozdzielczością. Co istotne, otrzymane mapy DSBs analizowane będą w kontekście trójwymiarowych danych dotyczących przestrzennej organizacji genomu ludzkiego, które zostały już uzyskane w naszym laboratorium metodą HiChIP dla badanych linii komórkowych.