Optymalizacja metody HiChIP w celu otrzymania wysokorozdzielczej mapy kontaktów chromatynowych stabilizowanych przez kohezynę w genomie ludzkim

Jednym z wyzwań współczesnej biologii jest poznanie przestrzennej organizacji genomu oraz zrozumienie jej wpływu na procesy zachodzące w komórce. Ostatnie badania pokazały, że chromosomy składają się z jednostek organizacyjnych nazywanych domenami (ang. chromatin contact domains, CCDs), powstających na skutek interakcji zachodzących pomiędzy odległymi od siebie w liniowej sekwencji regionami genomu. W komórkach ssaków, do głównych elementów zaangażowanych w ich tworzenie zaliczamy kohezynę, kompleks białkowy w kształcie pierścienia oraz zbudowane z 11 palców cynkowych białko CTCF. Kohezyna pełni istotną rolę w kluczowych procesach zachodzących w komórce takich jak transkrypcja, replikacja, naprawa DNA czy podział komórki. Jest również niezbędna podczas formowania pętli chromatynowych w procesie ekstruzji (ang. loop extrusion). Kohezyna działając jak silnik zależny od ATP przesuwa się wzdłuż DNA, powodujący aktywne wypętlanie nici, do momentu napotkania bariery w postaci białka CTCF.

Metody analizy struktury chromatyny typu 3C (ang. Chromosome Conformation Capture) umożliwiają badanie interakcji między poszczególnymi regionami DNA. Typowa procedura obejmuje: utrwalenie struktury chromatyny, trawienie enzymem restrykcyjnym, naprawę końców, ligację fragmentów znajdujących się blisko siebie oraz sonikację. W końcowym etapie przygotowane biblioteki genomowe są sekwencjonowane z wykorzystaniem metod NGS. Modyfikacje eksperymentów 3C, takie jak HiChIP lub ChIA-PET, wykorzystują etap immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), pozwalający na wykrywanie oddziaływań stabilizowanych przez konkretne białko. W praktyce, techniki analizy struktury chromatyny 3C wciąż stanowią duże wyzwanie eksperymentalne i wymagają pracochłonnej optymalizacji warunków eksperymentu w celu poprawy jakości, specyficzności i rozdzielczości uzyskanych wyników.

Głównym celem mojego projektu jest stworzenie wysokiej jakości mapy kontaktów mediowanych przez kohezynę dla ludzkiej limfoblastoidalnej linii komórkowej. Umożliwi to lepsze zrozumienie wpływu przestrzennej struktury genomu na procesy zachodzące w komórce. Pilotażowy eksperyment HiChIP dla limfoblastoidalnej linii komórkowej GM19238 pokazuje, że chociaż jakość otrzymanych przeze mnie wyników jest zbliżona do wcześniej opublikowanych danych dla innej linii komórkowej tego samego typu (Mumbach et al., 2016), to pozostaje jednak, w mojej opinii, niezadowalająca. Stosunek sygnał/szum jest zdecydowanie gorszy niż w przeprowadzonym przeze mnie eksperymencie CTCF-HiChIP. W rezultacie moje wyniki pozwoliły to na identyfikację w całym genomie jedynie 526 istotnie statystycznych pętli chromatynowych, około 25 razy mniej mniej niż w eksperymencie typu CTCF HiChIP. Wstępne wyniki wskazują więc na konieczność dalszej optymalizacji eksperymentu HiChIP dla kohezyny.

W projekcie w pierwszej kolejności skupię się na kluczowym w mojej opinii etapie immunoprecypitacji chromatyny. Wcześniejsze eksperymenty z użyciem techniki ChIP-qPCR pokazały, że dla kohezyny etap ten jest dużo mniej wydajny niż dla białka CTCF. Planuję weryfikację specyficzności komercyjnie dostępnych przeciwciał skierowanych przeciwko różnym podjednostkom pierścienia kohezynowego przy pomocy metody Western Blot, immunoprecypitacji (IP) i ChIP-qPCR. Przeprowadzona zostanie również optymalizacja protokołu ChIP, w celu wybrania warunków zapewniających najwyższą specyficzność reakcji. Ostatnim etapem będzie analiza kohezynowego MINIHiChIP dla ludzkiej limfoblastoidalnej linii komórkowej pochodzącej od rodziny portorykańskiej (ojciec – HG00731) z Projektu 1000 Genomów.